Các kỹ thuật trình tự dNA

Lĩnh vực công nghệ sinh học là một trong những thay đổi liên tục. Sự phát triển nhanh chóng và phát triển của các nghiên cứu tiên tiến phụ thuộc vào sự đổi mới và sự sáng tạo của các nhà khoa học và khả năng của họ để thấy tiềm năng trong một kỹ thuật phân tử cơ bản và áp dụng nó vào các quy trình mới. Sự ra đời của PCR đã mở ra nhiều cánh cửa trong nghiên cứu di truyền, bao gồm một phương tiện phân tích ADN và xác định các gen khác nhau dựa trên chuỗi DNA của chúng.

Trình tự DNA cũng phụ thuộc vào khả năng của chúng ta sử dụng điện di gel để tách các sợi ADN có kích thước khác nhau chỉ bằng một cặp cơ sở.

Trình tự DNA

Vào cuối những năm 1970, hai kỹ thuật lập trình DNA cho các phân tử DNA dài hơn đã được phát minh. Đó là phương pháp

Sanger (hoặc didexy) và phương pháp Maxam-Gilbert (hóa chất phân huỷ). Phương pháp Maxam-Gilbert dựa trên sự phân cắt nucleotide cụ thể bằng hóa chất và được sử dụng tốt nhất để sắp xếp các oligonucleotide (các polyme ngắn nucleotide, thường nhỏ hơn 50 cặp base-base). Phương pháp Sanger được sử dụng phổ biến hơn vì nó đã được chứng minh là dễ áp ​​dụng hơn về mặt kỹ thuật, và với sự ra đời của PCR và tự động hóa kỹ thuật, nó dễ dàng được áp dụng cho các sợi ADN dài bao gồm cả một số gen toàn bộ. Kỹ thuật này dựa trên sự chấm dứt chuỗi bởi dideoxynucleotides trong phản ứng kéo dài PCR. Phương pháp Sanger Trong phương pháp Sanger, đoạn DNA được phân tích là một khuôn mẫu và DNA polymerase được sử dụng, trong một phản ứng PCR, để tạo các sợi tóc miễn phí sử dụng mồi.

Bốn hỗn hợp phản ứng PCR khác nhau được điều chế, mỗi phần chứa một tỷ lệ nhất định các chất tương tự didexynucleoside triphosphate (ddNTP) với một trong bốn nucleotide (ATP, CTP, GTP hoặc TTP). Tổng hợp chuỗi DNA mới tiếp tục cho đến khi một trong những chất tương tự được kết hợp, vào thời điểm đó sợi này bị cắt ngắn sớm.

Mỗi phản ứng PCR sẽ kết thúc chứa một hỗn hợp các độ dài khác nhau của chuỗi ADN, tất cả kết thúc với nucleotide được gắn nhãn dideoxy cho phản ứng đó. Điện di gel sau đó được sử dụng để tách các sợi của bốn phản ứng, theo bốn làn đường riêng biệt, và xác định trình tự của bản gốc dựa trên những gì chiều dài của các sợi kết thúc bằng nucleotide.

Trong phản ứng tự động Sanger, mồi được sử dụng có nhãn với bốn màu huỳnh quang khác nhau. Các phản ứng PCR, với sự có mặt của các nucleotide didexy khác nhau, được thực hiện như đã mô tả ở trên. Tuy nhiên, tiếp theo, bốn hỗn hợp phản ứng sau đó được kết hợp và áp dụng cho một làn duy nhất của gel. Màu sắc của mỗi mảnh được phát hiện bằng cách sử dụng chùm laser và thông tin được thu thập bởi máy tính tạo ra các sắc ký đồ cho thấy các đỉnh cho mỗi màu, từ đó mẫu DNA có thể được xác định.

Thông thường, phương pháp lập trình tự động chỉ chính xác cho các trình tự có chiều dài tối đa khoảng 700-800 cặp base. Tuy nhiên, có thể thu được các trình tự đầy đủ của các gen lớn hơn, và trên thực tế, toàn bộ bộ gen, sử dụng các phương pháp bước đi như Primer Walking và Shotgun sequencing.

Trong

Primer Walking

, một phần khả thi của một gen lớn hơn được sắp xếp bằng cách sử dụng phương pháp Sanger. Các mồi mới được tạo ra từ một phân đoạn đáng tin cậy của chuỗi và được sử dụng để tiếp tục sắp xếp trình tự phần của gen nằm ngoài phạm vi phản ứng ban đầu.

Sự sắp xếp súng ngắn

đòi hỏi cắt ngẫu nhiên phân đoạn ADN cần quan tâm thành các mảnh có kích thước phù hợp hơn (có thể quản lý), sắp xếp từng đoạn và sắp xếp các miếng dựa trên các dãy chồng lên nhau. Kỹ thuật này đã được thực hiện dễ dàng hơn bằng cách áp dụng phần mềm máy tính để sắp xếp các miếng chồng chéo nhau.